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如何测定细胞内氯离子 (2009-12-21)

I.试剂

培养基-1

DME基础培养基(pH 7.4±0.05

10 mmol       TES

10 mmol       HEPES

2 mmol        L-谷氨酰胺

100 µg/ml     链霉素
    100 IU/ml     
青霉素G

10%           小牛血清

10%           胎牛血清

 

增殖用培养基

DME基础培养基(pH 7.4±0.05

10 mmol       TES

10 mmol       HEPES

2 mmol        L-谷氨酰胺

100 µg/ml     链霉素
    100 IU/ml     
青霉素G

10%           小牛血清  

 

培养基-2

DME基础培养基(pH 7.4±0.05

10 mmol       TES

10 mmol       HEPES

2 mmol        L-谷氨酰胺

20 µmol       L-阿拉伯糖苷

100 µg/ml     链霉素

100 IU/ml     青霉素G

10%           小牛血清

 

荧光试剂导入用缓冲液

Krebs-HEPES基础培养基(pH 7.3±0.05

20 mmol        HEPES

128 mmol       NaCl

2.5 mmol       KCl

2.7 mmol       CaCl2

1 mmol         MgSO4

16 mmol        葡萄糖

5 mmol         MQAE

 

标准曲线制备用缓冲液

Krebs-HEPES基础培养基(pH 7.3±0.05

20 mmol        HEPES

0 mmol         Na+

135 mmol       K+

1~135 mmol     Cl-

135~1 mmol     NO3-

5 µmol         尼日利亚菌素     

10 µmol        缬氨霉素

10 µmol        氢化三丁锡

 

洗涤、测定用缓冲液

Krebs-HEPES基础培养基(pH 7.3±0.05

20 mmol         HEPES

128 mmol        NaCl

2.5 mmol        KCl

2.7 mmol        CaCl2

1 mmol          MgSO4

16 mmol         葡萄糖

 

II.方法

1.细胞内氯离子浓度的荧光测定法

1)大鼠海马神经细胞的提取

按照BankerCowan的论文的方法,从18日龄的Wistaed大鼠胚胎中提取。

2)细胞培养

将用多聚赖氨酸处理过的盖玻片上的细胞,接种在培养皿中,加入培养基-1培养4 (375% CO2)

3) 细胞培养

在增殖用培养基中培养7-14 (375% CO2)。培养到第4天时更换成培养基-2,再培养24个小时(375% CO2)

4)使用缓冲液清洗3次。

5)荧光试剂导入细胞内

细胞在荧光试剂导入用缓冲液中培养1个小时 (37)

6)使用缓冲液反复清洗5次以上。

7)荧光测定

32的测定用培养基中用荧光显微镜(激发波长360 nm,荧光波长510 nm)测定荧光。

8)荧光测定/刺激物质

例:添加终浓度为0.3 mmol/l ethacrynic acid

                  32的测定用培养基中用荧光显微镜(激发波长360 nm,荧光波长510 nm)测定荧光。

 

2.绘制标准曲线并定量细胞内的氯粒子

1)按照1.的1-7)步骤,同样处理

2)荧光测定

用培养基配制几种已知浓度的氯离子标准液 (作标准曲线用),用荧光显微镜 (激发波长360 nm,发射

波长510 nm) 测定荧光。

3)标准曲线

按照1. 的第7)步测定各种已知浓度的氯离子标准液的荧光强度对应氯离子浓度制成标准曲线,用此标准曲线,可以计算出细胞内的氯离子浓度 (32)