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如何测定细胞内的pH (2009-12-21)

1.人中性粒细胞的细胞内pH测定

 

1). 试剂

·中性粒细胞 (从人血液中提取)

·HEPES缓冲液

(153 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l 葡萄糖, 20 mmol/l HEPES, pH 7.4)

·BCECF-AM special packaging

·标定用缓冲液

(130 mmol/l KCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgSO4, 10 mmol/l Na-MOPS)

·Nigericin

 

2). 染色及测定方法

a. HEPES制备细胞悬液,细胞浓度为4×10e7/ml

b. 加入1 mmol/lBCECF-AM溶液,终浓度为3 µmol/l,在37下孵育30分钟。

c. HEPES缓冲液充分清洗细胞外的BCECF-AM和凝集的中性粒细胞。

d. 用缓冲液将BCECF染色的细胞制成3×10e7/ml的细胞悬液。

e. 取适量的细胞悬液,细胞数量为3×10e6/ml,用荧光光度计测定荧光 (激发波长500 nm,发射波长530 nm)

f. 37下孵育10分钟后,添加刺激药物,记录荧光强度的变化。

 

3).标准曲线

a. 准确配制标定用缓冲液 (例如pH值:6.67.07.27.47.88.2 )

b. 从细胞悬液中取3×10e6/ml细胞,离心清洗后用1 ml标定缓冲液混合,制成细胞悬液。

c. 加入nigericin终浓度为10 µg/ml,孵育约10分钟后,测定荧光强度。

d. 横轴为缓冲液的pH值,纵轴为荧光强度作图。

 

2.注意事项

a. BCECF很难转入细胞,可以同Fura 2一样,用Pluronic F-127等表面活性剂。

b. 关于两个激发波长,详见参考文献1)5)

c. 请先将nigericin用乙醇配制成2 mg/ml的储备液。

 

 

 

 

     BCECF
 
 
 
 
 BCECF-AM