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如何用荧光法测定细胞内钙 (试剂盒) (2009-12-11)

I. 试剂盒内容

Fluo 3-AM

1 mg×1

DMSO

2 ml×1

Recording Medium (2x)

100 ml×2

250 mmol/l Prebenecid

2.5 ml×1

5% Pluronic F-127

5 ml×1

5% Cremophor EL

5 ml×1

 

II. 测定方法
1.
细胞培养
检测贴壁细胞时, 96孔板接种细胞数量约为15,000 /孔,如果用384孔板的话接种细胞数量约为5,000 /孔,推荐培养一个晚上后使用。
培养基量:96孔板:100 μl/
                  384
孔板:25 μl/孔。
2. Loading Buffer
的配制 (20Microplate)
1)
从试剂盒中取DMSO 1 ml,加到Fluo 3-AM (1 mg) 中使其充分溶解。
2)
准备200 ml的容量瓶,根据实验条件将任意量*1 5% Pluronic F-127 (5% Cremophor EL) 250 mmol/l Prebenecid 加至100 ml Recording Medium (2x) 中, 用纯水添加至全量200 ml,充分混合。(本试剂盒已经调节好最佳pH值在7.4左右)
3)
添加1 ml Fluo 3-AMDMSO溶液,用超声波震荡仪使其充分溶解,即成Loading Buffer
*1
我们推荐的浓度:Prebenecid:1.25 mmol/lPluronic F-127:0.04%,浓度可以根据条件的不同而变化。配制 200 ml Loading Buffer时,Prebenecid Pluronic F-127 (Cremophor EL) 的终浓度和添加量的关系,

P-4-1   250 mmol/l  Probeneci
溶液的添加量和终浓度
添加量(ml) 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
终浓度(mmol/l) 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50

 

P-4-2    5% Pluronic F-127 (5%Cremophor EL) 溶液的添加量和终浓度
添加量(ml) 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
终浓度(mmol/l) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

3. Recording Medium (1x) 的配制 (20Microplate)
1)
准备200 ml的容器,根据实验条件将任意量*2 250 mmol/l Prebenecid加至100 ml Recording Medium (2x) 中,用纯水添加至全量200 ml充分混合。(本试剂盒已经调节好最佳pH值在7.4附近)
2)
37培养箱内预热。
*2
我们推荐的浓度:Prebenecid-1.25 mmol/l,但是它的浓度可以根据条件的不同而变化。配制200 ml Recording Medium (1x) 时,Prebenecid检测的终浓度和添加量的关系参考如下表
P-4-3   250 mmol/l  Probenecid (溶液的添加量和终浓度)
 添加量(ml)   0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
终浓度(mmol/l)   0.50 0.75 1.00 1.25 1.50

4Fluo 3-AM染色细胞
1)
小心分离掉培养基,避免损伤细胞。添加以下量的 Loading Buffer到每孔中。
96
孔板:100 μl/孔,384孔板:25 μl/孔。
*
必要的话:在加Loading Buffer前,用预热至37PBS清洗细胞。
2)
37下孵育1个小时。
3)
小心地分离掉Loading Buffer,避免损伤细胞。加入37Recording Medium (1x)96孔板:100 μl/孔, 384孔板:25 μl/孔。*必要的话:在加Loading Buffer前,用预热至37PBS清洗细胞。
4)
用适合高通量筛选 (HTS) 的各种荧光酶标仪测定添加药物后的荧光强度变化 (激发波长480-500 nm,发射波长530 nm)

III.
注意事项
1)
本试剂盒需在冷冻条件下保存。
2) Fluo 3-AM
DMSO溶液和 Loading Buffer, Recording Medium一定要现配现用。
3)
Fluo 3-AM溶解后,由于Fluo 3-AM遇水易分解,很难长期保存,我们推荐一次使用完Loading Buffer