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三种常用的细胞增殖、毒性检测方法的原理、特点与比较
 
  MTT法检测原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan),而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
       Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理CCK-8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜,生成甲臜的量与细胞数成正比,可间接测定活细胞数量。
       乳酸脱氢酶(LDH)法检测原理:乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞质的一种酶,当细胞膜受到损伤时,LDH 会释放到培养基中。由于释放出的LDH 稳定,检测培养基中LDH 的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®可以测定受损细胞所释放出的LDH,其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH,NADH 通过电子载体可将水溶性四唑盐WST®(无色)还原成甲臜产物(橙色),WST®甲臜产物的吸光度与LDH 的量呈正比,利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。
方法
MTT CCK-8 LDH
产品 MTT CCK-8CK04 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®(CK12)
检测对象 活细胞 活细胞 死细胞
检测结果 细胞存活率 细胞存活率 细胞死亡(损伤)
用途 细胞增殖毒性 细胞增殖毒性 细胞毒性、细胞损伤
底物 MTT WST®-8 WST®
底物作用对象 线粒体内脱氢酶 细胞内脱氢酶 乳酸脱氢酶(LDH
检测方法 比色法 比色法 比色法
Formazan水溶性 不溶于水 溶于水 溶于水
优点 成本低 重现性好 无需使用放射性同位素51Cr
灵敏度高 适合做效靶细胞实验
操作简便 适合做ADCCCART实验
试剂稳定性高 试剂稳定性高
对细胞毒性小 对细胞毒性小
Formazan溶于水  
适合高通量筛选  
缺点 Formazan不溶于水,需用有机溶剂溶解 CCK-8试剂和酚红颜色接近,有时会有漏加或多加的情况 血清浓度高时会有干扰
对细胞有毒性 灵敏度比放射性同位素51Cr
操作繁琐,增加误差
不适合悬浮细胞
试剂需现配现用
产品性状 粉末 液体 液体、冻干粉
 
 
         MTT法和CCK-8法反映的是细胞的存活率,虽然也可以间接反映细胞毒性,但当外在因素改变(线粒体)脱氢酶活性时,有时结果就会出现偏差。这时最好的方法是同时测定LDH的释放来验证细胞的损伤率,用2种方法来相互验证会使结果更可靠,更有说服力。
        在体外细胞损伤模型实验中,往往需要同时检测多种指标来验证,例如:细胞存活率(MTT法或CCK-8法)、细胞凋亡(Annexin V-FITC)、细胞损伤(LDH法)、ROS、SODGSH、MDA、线粒体膜电位等指标。有关详细内容请参见体外细胞损伤模型的检测指标
  
  
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Cell Counting Kit-8(货号:CK04)                             
*:Cytotoxicity LDH Assay Kit- WST®  由于样品数量有限,先申请先得,发完为止,如未能申请到,敬请谅解。
〇 MTT
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使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®的细胞损伤实验
 
  1960年Nachlas等进行了以乳酸脱氢酶(LDH)的释放为指标的细胞损伤实验后,以检测LDH作为一种确认细胞状态方法的相关文献在全球的数量越来越多(图1)。本次例举4篇近年发表过的文献,均通过检测LDH的释放确定细胞损伤率。
 
 
图1  同时检测LDH释放及活细胞(MTT、CCK-8等方法)的文献数量变化
(本数据由同仁化学研究所调查)
 
  Watanabe等研究水通道蛋白(AQP,膜蛋白质)的机理及与疾病的关联1)。已知AQP与细胞内水的转运有关,近年的研究表明,AQP也会透过甘油、H2O2等小分子,甚至对细胞增殖及迁移产生影响。Watanabe等为证实AQP-9对H2O2转运的影响,通过利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2细胞及H2O2荧光探针(CM-H2DCFDA)进行细胞对外源性H2O2的抑制实验。实验中,利Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®测LDH的释放并确定由抑制H2O2转运引起的细胞伤率。结果,对照组正常细胞进行H2O2转运并检测到CM-H2DCFDA荧光,同时检测出LDH释放确认细胞受损。实验组细胞敲除AQP-9,细胞内没有检测出H2O2,并通过测定LDH的释放确认没有发生细胞损伤(图2)。
 
 
图2  检测AQP-9敲除的细胞内H2O2及LDH的释放
 
  Shu-fang Jin等研究突发性肺纤维化治疗药Pirfenidone(图3)的作用机能,其中合Cell Counting Kit-8(CCK-8)Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®进行评价2)。结果Pirfenidone对老鼠纤维芽细胞C3H10T1/2的增殖及纤维化有一定抑制并能够增强激酶抑制剂XL413的效果,利CCK-8检测XL413加入前后,Pirfenidone对细胞增殖的抑制率,结Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®确认细胞的增殖抑制并非由XL413本身引起。
 
 
图3  Pirfenidone及XL413的结构式
 
  此外,Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮细胞(HEECs)ATP的释放,同时确认有无LDH释放增加3)。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine对原代神经细胞诱导凋亡后,以caspase3、Annexin VLDH为指标进行测定4)。对于细胞损伤而言,通过检测几种不同原理的指标进行实验结果的相互验证。同仁化学研究所生产并销售各类细胞增殖、毒性、损伤检测试剂盒及细胞染色等试剂,旨在以此帮助实验者阐明细胞内各类机理。
 
  
《参考文献》
1)  S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.
2)  S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.
3)  L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.
4)  S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.