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Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
货号: SG03

细胞衰老检测试剂盒 - SPiDER-βGal
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10assays (35mm dish)4140现货

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《原理》
图1  用SPiDER-βGal检测衰老细胞的原理
 
      正常细胞的DNA损伤是由细胞的不断分裂和氧化应激引起。细胞衰老是一种不可逆的细胞生长抑制状态,它可以抑制DNA受损细胞的生长。细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)在衰老细胞中过表达,被广泛作为细胞衰老的标识之一。用X-Gal染色检测SA-β-gal是一种常用的方法,但此方法存在3个缺点;
          1) 由于细胞透膜性差,需要固定细胞
          2) 由于很难区分染色细胞和未染色细胞,所以定量困难
          3) 染色时间长
      本试剂盒检测SA-β-gal灵敏度高、方法简便。SPiDER-βGal是一种检测SA-β-gal的新型试剂,具有细胞透膜性高、细胞内荧光持续时间长的特点。SA-β-gal不仅在固定细胞中被检测到,也可以在活细胞中被特异性地检测到(用Bafilomycin A1抑制内源性β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的活性后)。因此可用SPiDER-βGal来进行定量分析。
《实验例1》
SA-β-gal与DNA损伤标志物γ-H2AX共染色
1、将传代1次与10次的细胞孵育在38孔板中,其余以操作手册为准
2、添加4% PFA/PBS于细胞中,室温孵育15 min后,PBS清洗细胞3次。
3、添加0.1% Triton X-100/PBS于细胞中,室温孵育30 min后,PBS清洗细胞3次。
4、添加1% BSA/PBS于细胞中,室温孵育1 h
5、添加1% BSA/PBS稀释的抗γ-H2AX抗体(兔),4℃下孵育过夜后,PBS清洗细胞3次。
6、添加1% BSA/PBS稀释的荧光二抗(Alexa  Fluor 647)于细胞中,室温孵育2 h后,PBS清洗细胞3次。
7、添加浓度为2 μg/ml DAPI (code: D523)PBS溶液于细胞中,室温孵育10 min后,PBS清洗细胞3次。
8激光共聚焦显微镜下观察。
                                                             
                                                   图1  分别培养传代1 次与传代10 次细胞后进行染色观察。
                                    a)衰老细胞中SA-β-gal被清晰标记     b) γ-H2AX 标记DNA链断裂损伤
                                    c)DAPI用于定位标记细胞核.            d) 三种荧光染料合成图( merge
                               (绿色:SPiDER-βGal,红色:γ-H2AX二抗-Alexa Fluor 647,蓝色:DAPI)
 
 
《实验例2》
SA-β-gal的荧光成像
1. 在35 mm μ-dish(ibidi公司)中接种传代数为0和12代的Wl-38细胞(5×104 cells/dish、10% FBS、1% 青霉素-链霉素的MEM培养基)后, 在37℃、5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基后,用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后,在37℃,5% CO2培养箱中培养1小时。
4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后,在37℃,5% CO2培养箱中培养30分钟。
5. 去除上清液、用2 ml HBSS洗涤2次、再加入2 ml HBSS后,用共聚焦荧光显微镜观察(激发波长:488 nm,发射波长:500-600 nm)。

图2  Wl-38细胞的SA-β-gal荧光成像图
A. 传代数为0代的Wl-38细胞,B. 传代数为12代的Wl-38细胞
(绿色:SPiDER-βGal,蓝色:Hoechst 33342)

《实验例3》
用流式细胞仪定量分析SA-β-gal阳性细胞
1. 在35 mm μ-dish(ibidi公司)中接种传代数为1和12代的Wl-38细胞(1×105 cells/dish,含有10% FBS,1% 青霉素-链霉素的MEM培养基)后,在37℃、5% CO2培养箱中过夜培养。
2. 去除培养基后,用2 ml HBSS洗涤1次。
3. 加入1 ml Bafilomycin A1工作液后,在37℃、5% CO2培养箱中培养1小时。
4. 加入1 ml SPiDER-βGal工作液后,在37℃、5% CO2培养箱中培养30分钟。
5. 去除上清液后,用2 ml HBSS洗涤2次。
6. 用200 μl 胰蛋白酶溶液消化细胞、加入1,000 μl MEM培养基(含有10% FBS、1% 青霉素-链霉素)后,用流式细胞仪检测(激发波长:488 nm,荧光波长:515-545 nm)。

图3  定量SA-β-gal阳性的Wl-38细胞
 
《参考文献》
1) T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y. Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura and Y. Urano, Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 9620.