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-Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting-
货号: DK02

DNA损伤定量试剂盒-AP位点计数-
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20 samples3650现货

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特点:测定基因组DNA样品中无碱基位点的数目
            
比色微板法检测
           
检测范围:1-40abasic sites / 1×105个碱基对的DNA


DNA
的氧化损伤是由于DNA与活性氧(ROS)尤其是羟自由基之间的相互作用造成的。由超氧阴离子和过氧化氢通过Fenton反应产生的羟自由基在DNA中产生多重修饰。羟自由基对脱氧核糖基团的氧化攻击将导致DNA释放自由碱基,产生链断裂、各种糖修饰以及单个无碱基位点(AP位点)。事实上,AP位点是由ROS产生的损伤的主要类型。醛反应性探针(ARPN’-氨氧基甲基羰基肼-D-生物素)特异性地与AP位点的开环上的醛基反应。通过这个反应可以检测到导致醛基形成的DNA修饰。用过量ARP试剂反应后,DNA上的所有AP位点均用生物素做了标签。可以用亲和素-生物素法,用连接到亲和素上的过氧化物酶或碱性磷酸酶做比色法检测来对这些带有生物素标签的AP位点进行计数。DNA损伤定量试剂盒包含用于检测每1×105个碱基对中140AP位点的所有必需溶液。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

试剂盒内含:20 samples
ARP solution ……………………250 μl × 1
             DNA binding solution………10 ml × 1
ARP-DNA standard soln………
不同浓度各250 μl      Substrate solution…………10 ml × 1
Filtration tube……………………20
                         TE buffer………………………40 ml × 1
Washing buffer…………………1
                              HRP-streptavidin……………25 μl × 1
96
孔板……………………………1

 

检测步骤
1. 
向样品DNA溶液中加入ARP溶液。37下孵育1小时。
2. 
ARP反应混合液转移到过滤管中,离心以纯化ARP-标记的DNA
3. 
ARP-DNA标准溶液或ARP标记的样品DNA溶液加到各孔中。加入DNA结合溶液,并将培养板置于室温下过夜。
4. 
倒掉溶液并用洗涤缓冲液洗涤各孔。将板放在纸巾上轻拍几次以尽可能干净地去除缓冲液。
5. 
HRP-抗生蛋白链菌素溶液加到每孔中并置于37下孵育1小时。
6. 
倒掉溶液并用洗涤缓冲液洗涤各孔。将板放在纸巾上轻拍几次以尽可能干净地去除缓冲液。
7. 
将底物溶液加入各孔中并置于37下孵育1小时。
8. 
测定650 nmO.D.值。

 

ARP反应(制备ARP标记的DNA
1. 
0.5 ml管中混合10 μl纯化的基因组DNA溶液(100 μg/ml)和10 μl ARP溶液,37下孵育1小时。
2. 
100 μl TE洗涤过滤管内侧。
3. 
ARP标记的DNA溶液中加入380 μl TE,并将此溶液加入过滤管中。a)
4. 
5,000 g离心过滤管15分钟,倒掉滤出液。
5. 
向过滤管内加入400 μl TE,用移液器将过滤膜上的DNA重悬。
6. 
5,000 g离心过滤管15分钟。b)
7. 
向过滤管中加入200 μl TE并用移液器将过滤器上的DNA重悬。
8. 
ARP标记的DNA溶液转移到1.5 ml管中,并向过滤管中再加入200 μl TE以完全将ARP标记的DNA从过滤器转移到1.5 ml管中。c)
9. 
ARP标记的DNA溶液储存于0-5
a) 
可用乙醇沉淀代替过滤管来纯化ARP标记的DNA。乙醇沉淀后,将DNA沉淀物溶解到100 μl TE中,并测定DNA浓度。
b) 
如果离心后DNA溶液残留在过滤器上,再离心5分钟,接着按步骤7操作。
c) 
使用过滤管的DNA回收率为90%,因此ARP标记的DNA的浓度大约为2.25 μg/ml。为更准确地测定样品DNA中无碱基位点的数目,我们建议测定准确的DNA浓度值。

 

ARP标记的基因组DNA的分离过程
--
ARP标记的DNA溶液(20 μl)中加入380 μl TE
--
步骤i)
100 μl TE洗涤过滤杯。接着,将400 μl ARP标记的DNA溶液加入到过滤管中并以2,500 g离心15分钟。
--
步骤ii)
倒掉滤出液,并加入400 μl TE。以5,000 g速度离心15分钟。
--
步骤iii)
加入200 μl TE,并冲洗过滤管若干次,使过滤器中的DNA溶解,将ARP标记的DNA溶液转移到1.5 ml的管中。重复此步骤。
--
纯化ARP标记的DNA溶液:400 μl
DNA
浓度:2.25 μg/ml

DNA中无碱基位点数目的测定


第一天
1. 
310 μl TE稀释90 μl ARP标记的DNA溶液。
2. 
每孔中加入60 μl ARP-DNA标准溶液。每个浓度的ARP-DNA标准溶液三个孔。
3. 
每孔中加入60 μl稀释的ARP标记的DNA溶液。每个样品三个孔。
4. 
向每孔中加入100 μl DNA结合溶液并混合。将培养板置于室温下过夜。


第二天
5. 
溶液的制备
       
洗涤缓冲溶液:将洗涤缓冲液包的内容物溶解到1 L去离子水或蒸馏水中。室温储存此洗涤缓冲液。
        HRP-
抗生蛋白链菌素溶液:用洗涤缓冲液稀释HRP-抗生蛋白链菌素以制备HRP-抗生蛋白链菌素工作溶液。
6. 
倒掉各孔中的DNA结合溶液并用250 μl 洗涤缓冲液洗涤各孔5次。倒掉洗涤缓冲液后,将培养板倒置并轻拍几次以完全去除该溶液。
7. 
向每孔中加入150 μl稀释的HRP-抗生蛋白链菌素工作溶液并置于37下孵育1小时。
8. 
倒掉各孔中的溶液,用250 μl 洗涤缓冲溶液洗涤各孔5次。
9. 
向每孔中加入100 μl底物溶液并置于37下孵育1小时。
10. 
测定650 nm处的O.D.值,并使用从ARP-DNA标准溶液孔得到的数据制作校准曲线。
11. 
使用标准曲线确定基因组DNA中的无碱基位点的数目。

 

如何制备典型标准曲线
1. 
计算每个ARP-DNA标准溶液的平均O.D.值。
2. 
用平均O.D.值减去空白O.D.值。a)
3. 
绘出标准溶液的AP位点数目对应的O.D.值。X轴为AP位点数目,Y轴为O.D.值。
4. 
使用此标准曲线确定样品中的AP位点数目。
a) 
空白O.D.值约为0.04-0.06,且40ARP-DNA标准溶液的O.D.值约为0.8-1.0O.D.值取决于HRP-抗生蛋白链菌素的活性。

 

 

 

1.可否使用单链DNA或RNA?

不可以将此试剂盒用于确定单链DNA或RNA的无碱基位点的数目。由于微量培养板上的结合效率,单链DNA的O.D.读数约为双链DNA的两倍。

2.如何储存基因组DNA?

如果DNA不能在分离后立即用ARP标记,则制备DNA片状沉淀物并存放于-20℃或-80℃。ARP标记后,样品可于4℃下在TE缓冲液中存放几个月。

3.如何制备DNA?

您可以使用常用的方法或购买的DNA分离试剂盒。在DNA分离过程中,每1×10E5个碱基对会产生2到4个无碱基位点。因此,使用相同分离方法制备每个DNA样品。

4.如果样品DNA浓度低于100 μg/ml,应该怎么办?

可以使用过滤管浓缩您的样品DNA或用乙醇沉淀把DNA制成片状沉淀物并将其溶解制备成100 μg/ml的溶液。

5.如果样品DNA少于1 μg该怎么办?

加入相同体积的ARP溶液并依照操作手册操作。ARP标记的DNA的回收率可能低于通常的反应,因此测定该ARP标记的DNA溶液。0.5 μg DNA和0.25 μg DNA的平均回收率分别为70%和50%。

6.如果平均每1×10e5个碱基对有不止40个无碱基位点,如何确定无碱基位点的数目?

使用TE缓冲液,将ARP标记的样品DNA用0.5 μg/ml双链基因组DNA (例如小牛胸腺或鲑鱼精子DNA) 稀释。