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-SulfoBiotics- Biotin-HPDP(WS) solution
货号: SB17

生物素标记蛋白质巯基标记试剂(水溶性)
CAS号:
规格
价格
到货期
500μl1670期货

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  • 参考文献
Biotin-HPDP(WS)是一款在Biotin-HPDP(货号:B573)基础上改良的,新型水溶性生物素标记试剂。
传统的Biotin-HPDP通过与蛋白中的巯基结合,形成可逆的二硫键,从而在蛋白中引入生物素结构。由于二硫键(-S-S-)可被还原剂还原为自由巯基(-SH),因此标记了生物素的蛋白,通过亲和素包被的颗粒(Avidin-Coated Beads)结合后,再使用还原剂可以达到亲和纯化生物素化蛋白的效果(图1)。因此Biotin-HPDP被广泛应用于生物素转换方法(Biotin Switch Assay),可以用来检测蛋白质巯基亚硝基化(s-Nitrosylation)、棕榈酰化(s-Palmitoylation)、二硫键水解(s-Sulfhydration)等。
但是Biotin-HPDP水溶性差,配制工作液需要花费大量时间,即使改用DMSO和 DMF效果也不明显。在此基础上我公司研发了新一代水溶性的蛋白质巯基标记试剂—Biotin-HPDP(WS)。
试剂内含
20 mmol/l Biotin-HPDP(WS) Solution 500 μl x 1
 
储存条件
0-5℃
 
注意事项
开盖前请短暂离心,防止试剂在瓶体或瓶盖内有少量粘附
 
工作液制备
根据您的实验设计,选择水或合适的缓冲液来稀释Biotin-HPDP(WS) Solution。
请不要使用还原性溶剂如:二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇(2ME)等,会影响生物素的标记
 
实验例
GAPDH标记生物素和使用亲和素磁珠纯化
 
所需的设备和材料
37℃培养箱;20 µl,200 µl,1,000 µl移液器;
离心机;多功能成像仪;1.5 ml微量管;10 K过滤管;
-Lysis Buffer : 6 mol/l Urea, 2% SDS, 150 mmol/l Tris-HCl (pH 7.4)
-RIPA Buffer : 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8.0), 150 mmol/l NaCl, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% NP-40
-NeutravidinTM Agarose (Thermo Fisher Scientific)
-Neutralization Buffer : 20 mmol/l HEPES (pH 7.7), 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA,
0.5% TritonX-100
-Neutralization Buffer (+600 mmol NaCl) : Neutralization Buffer, 600 mmol NaCl
-Elution Buffer : 20 mmol/l HEPES (pH 7.7), 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 100 mmol/l 2-Mercaptoethanol
-Loading Buffer:10% SDS,50% Glycerol,0.2 mol/l Tris-HCl(pH 6.8),0.05% Bromophenol blue
 
操作步骤
(1)在1.5 ml微量管中加入35 µl的Lysis Buffer、5 µl 100 mmol/l  DTT(溶解于5 µl Lysis Buffer中)和10 µl 1 mg/ml GAPDH(36 kDa)溶液(溶解于PBS中)涡旋振荡充分混合。
(2) 在37℃培养30 min后,整体转移至10 K的过滤管中,在12,000 rpm 离心10 min。
(3)在过滤管中加入50 µl的PBS,然后在12,000 rpm 离心10 min。
 (4) 重复步骤3。
 (5) 在过滤管中加入126 µl RIPA Buffer和14 µl 4 mmol/l Biotin-HPDP (WS)水溶液,用移液器吹打混匀,Biotin-HPDP (WS)的终浓度为400 µM。
 (6) 过滤管在37℃培养1 h后,在12,000 rpm 离心10 min。
 (7) 在过滤管中加入50 µl的PBS,然后在12,000 rpm 离心10 min。
 (8) 重复步骤7
(9) 加入400 µl的Neutralization Buffer,用移液器吹打,使标记上生物素的蛋白充分溶解后,将溶液转移至1.5 ml的微量管中。
 (10) 取50 µl步骤9中的溶液加入含有NeutravidinTM Agarose磁珠的小管中。
NeutravidinTM  Agarose 磁珠在反应前先用Neutralization Buffer清洗处理。
 (11) 将溶液放在4℃中培养1 h。
 (12) 将小管在2,500 rpm 离心1 min,用移液器去除上清液。
 (13) 取1 ml的Neutralization Buffer (+600 mmol/l NaCl)加入小管后,在2,500 rpm 离心1 min,用移液器去除上清液。
(14) 重复步骤13二次。
 (15) 取1 ml的Neutralization Buffer)加入小管后,在2,500 rpm 离心1 min,用移液器去除上清液。
(16) 重复步骤15。
(17)取50 µl的Elution Buffer加入小管中漩涡震荡使之充分混合后,溶液在4℃中培养1 h。
(18) 将小管2,500 rpm 离心1 min后,转移10 µl上清液至1.5 ml微量管中。
(19)取2 µl的Loading Buffer加入微量管中,此溶液可用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(CBB染色)和Western Blotting实验。
 
GAPDH的提纯检测(Biotin-HPDP与Biotin-HPDP(WS)的对比)
条带1:Biotin-HPDP
条带2:Biotin-HPDP (+NEM Blocking)
条带3:Biotin-HPDP(WS) Solution
条带4: Biotin-HPDP(WS) Solution (+NEM Blocking)
一抗:兔抗GAPDH抗体
二抗:山羊抗兔抗体结合过氧化物酶发光检测
※相同浓度的Biotin-HPDP与Biotin-HPDP(WS)对比结果显示Biotin-HPDP与Biotin-HPDP(WS)具有相同的性能。