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 细胞增殖/毒性/损伤/保护检测的指标
 
【细胞活性】
【线粒体活性】
〇 MTT
【细胞坏死/LDH漏出】
【细胞凋亡】
【超氧化物歧化酶(SOD)】
谷胱甘肽(GSH)】
线粒体膜电位】
细胞核】
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细胞增殖、毒性各种检测方法的特点与比较
 
  MTT法和Cell Counting Kit-8(CCK-8)法是利用还原性显色试剂与活细胞中脱氢酶反应,通过检测吸光度计算细胞数量的方法。由于该方法简便、安全、重复性好等优点,被广泛应用于细胞增殖、毒性等实验中。
  然而,在检测细胞毒性时,除了MTT法CCK-8法,这类以脱氢酶活性为检测指标的方法外,也可以检测因细胞膜损伤而释放的LDH活性。因为,在利CCK-8法检测细胞毒性时,虽然能得出细胞死亡率,但很难判断是由于细胞数量的减少,还是细胞内脱氢酶活性降低导致的。所以,这时候可以利用细胞体外的LDH活性等其他指标进行检测。
 
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〇 MTT
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使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST的细胞损伤试验
 
  1960年Nachlas等进行了以游离乳酸脱氢酶(LDH)为指标的细胞损伤试验后,以检测LDH作为一种确认细胞状态方法的相关文献在全球的数量越来越多(图1)。本次例举4篇近年发表过的文献,均通过检测游离LDH确定细胞损伤率。
 
 
图1  同时检测游离LDH及活细胞(MTT、CCK-8等方法)的文献数量变化
(本数据由同仁化学研究所调查)
 
  Watanabe等研究水通道蛋白(AQP,膜蛋白质)的机理及与疾病的关联1)。已知AQP与细胞内水的转运有关,近年的研究表明,AQP也会透过甘油、H2O2等小分子,甚至对细胞增殖及迁移产生影响。Watanabe等为证实AQP-9对H2O2转运的影响,通过利用siRNA得到AQP-9基因沉默的HepG2细胞及H2O2荧光探针(CM-H2DCFDA)进行细胞对外源性H2O2的抑制实验。实验中,利Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST测游离LDH并确定由抑制H2O2转运引起的细胞伤率。结果,对照组正常细胞进行H2O2转运并检测到CM-H2DCFDA荧光,同时检测出游离LDH确认细胞受损。实验组细胞敲除AQP-9,细胞内没有检测出H2O2,并通过测定游离LDH确认没有发生细胞损伤(图2)。
 
 
图2  检测AQP-9敲除的细胞内H2O2及游离LDH
 
  Shu-fang Jin等研究突发性肺纤维化治疗药Pirfenidone(图3)的作用机能,其中合Cell Counting Kit-8(CCK-8)Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST进行评价2)。结果Pirfenidone对老鼠纤维芽细胞C3H10T1/2的增殖及纤维化有一定抑制并能够增强激酶抑制剂XL413的效果,利CCK-8检测XL413加入前后,Pirfenidone对细胞增殖的抑制率,结Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST确认细胞的增殖抑制并非由XL413本身引起。
 
 
图3  Pirfenidone及XL413的结构式
 
  此外,Liping Wu等研究弱酸刺激人上皮细胞(HEECs)ATP的释放,同时确认有无游离LDH增加3)。Wakatsuki等使用6-hydroxydopamine对原代神经细胞诱导凋亡后,以caspase3、Annexin V及游离LDH为指标进行测定4)。对于细胞损伤而言,通过检测几种不同原理的指标进行实验结果的相互验证。我司生产并销售各类细胞增殖、毒性、损伤检测试剂盒及细胞染色等试剂,旨在以此帮助实验者阐明细胞内各类机理。
 
  
《参考文献》
1)  S. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 2016, 471, 191.
2)  S. Jin, et al., Exp. Cell. Res., 2015, 339, 289.
3)  L. Wu, et al., Am. J. Physiol. Gastroinest. Liver Physiol., 2015, 309, G695.
4)  S. Wakatsuki, et al., J. Cell. Biol., 2015, 211, 881.
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对受损伤细胞保护的检测方法
 
      很多因素会损伤细胞,例如:缺氧、缺血再灌注、活性氧(ROS)、化学物质(药物)等都能损伤细胞。细胞损伤后会给人带来各种疾病,因此对损伤细胞的保护变得越来越重要,近年来对受损伤细胞的保护研究受到越来越多的重视。
 
 
如图
(本数据由敝社调查)
 
对损伤细胞保护的检测指标有很多,下面我们介绍主要的7种检测指标。
 
1. 细胞存活力
      张骏等人在绿原酸对心肌缺血 - 再灌注损伤的防护1)的研究中设置了3个组,分别是对照组,缺氧复氧组和绿原酸干预组,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法检测心肌细胞的存活率,结果显示和缺氧复氧组相比,绿原酸干预组心肌细胞活性明显升高,表明绿原酸对细胞有促生长作用。
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〇 MTT
 
2. 乳酸脱氢酶(LDH)
      LDH是存在于细胞质中的一种酶,当细胞膜受到损伤时,LDH会释放到培养基中。检测培养基中LDH的量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。
      孟富慧等人在研究硫化氢供体对皮肤细胞的保护2)中,设计了H2O2诱导皮肤细胞损伤模型,用四硫代钼酸铵(ATTM)作为新型硫化氢供体,结果显示与H2S供体GYY4137类似,ATTM在细胞培养基中可剂量依赖性地释放H2S,在H2O2处理前给予ATTM预处理,细胞死亡率降低,有明显的细胞保护作用。表明四硫代钼酸铵可保护人皮肤细胞对抗氧化应激诱导的损伤效应。
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3. 细胞凋亡
      活性氧(ROS)可引起细胞凋亡,在细胞凋亡早期,膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V可以与磷脂酰丝氨酸特异结合。用绿色荧光FITC标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。
      王莹莹等人在研究人参皂苷Rg1保护冈田酸诱导的PC12细胞损伤3)中,用Annexin V-FITC/PI试剂盒结合流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示冈田酸诱导PC12细胞凋亡,而人参皂苷Rg1可以减少冈田酸诱导PC12细胞早期凋亡的细胞数量,表明人参皂苷Rg1具有保护冈田酸诱导的PC12细胞损伤的作用。
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4. 超氧化物歧化酶(SOD)
      SOD能够催化超氧阴离子(O2•-)歧化,生成过氧化氢以及单质氧,是一种重要的抗氧化酶,保护细胞免受损伤。
      叶红等人在研究人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的肾保护4)中,实验设计清洁级昆明小鼠36只按体重随机分为正常组、模型组(D-半乳糖)和实验组(Rg1),3组均12只。模型组和实验组,给予腹腔注射D-半乳糖诱导小鼠亚急性衰老模型,采用SOD Assay Kit - WST检测SOD活性,结果显示实验组SOD 活性显著高于模型组。结论,人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠肾具有一定的保护作用。
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5. 谷胱甘肽(GSH)
      GSH可以清除ROS和氧自由基,具有抗氧化和保护细胞的作用。
      韩知峡等人在研究谷胱甘肽对小鼠肾脏氧化损伤的保护5)中,将40只健康清洁级昆明小鼠分为5组,分别为生理盐水组、GSH对照组、微囊藻毒素-LR(MC-LR)染毒组、GSH低剂量+MC-LR染毒组、GSH高剂量+MC-LR染毒组,每组8只(雌雄各半),取出肾脏检测GSH含量。结果显示与生理盐水组对比,MC-LR染毒组抗氧物质GSH含量明显降低。与MC-LR染毒组对比,GSH+MC-LR染毒组的抗氧化物质GSH含量增加。说明了给予一定剂量的外源性GSH能够对抗MC-LR引起肾脏细胞氧化应激损伤,提高肾脏细胞的抗氧化能力。
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6. 线粒体膜电位
      线粒体膜电位改变与细胞氧化损伤和凋亡发生密切相关,氧化损伤造成膜电位下降,诱导细胞凋亡。
      孟富慧等人在研究硫化氢供体对皮肤细胞的保护2)中,设计了H2O2诱导皮肤细胞损伤模型,用四硫代钼酸铵(ATTM)作为新型硫化氢供体,用荧光染料Rh123检测线粒体膜电位,结果显示用H2O2处理可降低细胞的ΔΨm,而在细胞遭受损伤前给予200 μmol/l ATTM预处理可明显提高ΔΨm。表明四硫代钼酸铵可保护人皮肤细胞对抗氧化应激诱导的损伤效应。
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7. 细胞核
      当细胞受到损伤后会导致细胞膜破裂,用Hoechst 33258Hoechst 33342可以染色受损细胞的细胞核,从细胞形态学观察细胞的损伤情况。
      韩岚等人在研究桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧损伤PC12细胞的保护6)中,采用Na2S2O4联合低糖培养基建立体外缺糖缺氧致PC12细胞损伤模型,分别给予不同浓度的桃红四物汤含药血清。Hoechst 33258染色结果表明桃红四物汤含药血清能降低缺糖缺氧诱导的细胞凋亡。结论,桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。
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<参考文献>
1)  张骏等,绿原酸对心肌缺血 - 再灌注损伤的防护作用基础研究,中国药业201524(17), 3-52)  孟富慧等,四硫代钼酸铵作为新型硫化氢供体的鉴定及其对皮肤细胞的保护作用,中国病理生理杂志201531(12), 2271-22763)  王莹莹等,人参皂苷Rg1通过抗氧化应激保护冈田酸诱导的PC12细胞损伤,中国药理学通报201632(10), 1064-10704)  叶红等,人参皂苷Rg1对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的肾保护机制研究,中国临床药理学杂志201531(14), 1435-14385)  韩知峡等,谷胱甘肽对微囊藻毒素-LR所致小鼠肾脏氧化损伤的保护作用研究,重庆医学201645(3), 320-322
6)  韩岚等,桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧损伤PC12细胞的保护作用,安徽中医药大学学报201635(1), 63-67
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